【2017年诺贝尔化学奖特别报导】将生命捕捉在原子的细节中

2020-06-11  阅读 713 次

【2017年諾貝爾化學獎特別報導】將生命捕捉在原子的細節中

Jacques Dubochet (杜波克特)、Joachim Frank (法兰克)、与Richard Henderson (韩德森)获得了今年诺贝尔化学桂冠,表彰他们为取得生命分子的三维影像所发展的一种有效方法。运用低温电子显微术,研究人员现在能冻结行动中的分子并以原子的尺度描绘之,这种技术将生物化学带入了一个新的纪元。

过去这几年,各种生物分子机器令人惊讶的结构充斥在各种科学文献中(图一):沙门氏桿菌(salmonella)攻击细胞所用的注射针;具有抵抗化学治疗及抗生素的蛋白质;控制昼夜节律的蛋白质错合物;光合作用中捕捉光线的反应错合物以及一个能让我们听见的压力感测器,这些只是现在用低温电子显微术(简称cryo-EM)显像的数百个生物分子中的几个例子。

当研究人员开始怀疑兹卡(Zika)病毒是造成巴西新生儿脑部损伤的流行病元凶时,他们利用cryo-EM来观察这个病毒,在几个月内就得到具有原子解析度的病毒三维影像,使得研究者能开始寻找其结构中潜在的药物标靶。

【2017年诺贝尔化学奖特别报导】将生命捕捉在原子的细节中

图一 过去这几年研究工作者发表了许多複杂的蛋白质错合物结构 a. 一个控制昼夜节律的蛋白质错合物 b. 一个读取耳内压力变化的感测器,让我们听到声音 c. 兹卡(Zika)病毒

杜波克特法兰克、与韩德森等人突破性的发现,成就了cryo-EM的发展,这个方法带领生物化学进入了一个新的纪元,让它比以前更容易捕捉生物分子的影像。

影像 ─ 获取知识的重要关键

在20世纪前半页,生物分子 – 蛋白质、DNA以及RNA – 仍是生物化学的地图中一块未知的新大陆。科学家知道这些分子在细胞内扮演着十分重要的角色,但却对它们的外观毫无概念。直到1950年代,剑桥大学的科学家们把蛋白质结晶放到X射线底下,才能够第一次看出其波浪和螺旋形的结构。

1980年代早期,X射线晶体学与核磁共振谱法(NMR spectroscopy)分别用来研究固体和溶液中的蛋白质。这种技术不只揭示了蛋白质的结构,也暴露了它们如何移动以及与其它分子相互作用。

多亏了这两种方法,现在我们有包含数千种生物分子模型的资料库,能够用于从基础研究到药物发展的各个领域。然而,这两种方法都有其根本上的限制。溶液的核磁共振谱法只适用于比较小的蛋白质,X射线晶体学则需要分子形成结构整齐的晶体,像是水结成冰一样,而这些晶体影像就像早期相机取得的黑白肖像 – 它们僵硬的姿态几乎无法显示出蛋白质的动力学。

此外,很多分子无法自行排列形成晶体,这让韩德森在1970年代放弃了使用X射线晶体学 – 这也正是2017年诺贝尔化学奖故事的开端。

晶体的诸多问题使韩德森转换跑道

韩德森的博士学位是在X射线晶体学的堡垒 – 英国剑桥获得的。他运用X射线晶体学使蛋白质成像,但在试图结晶一种天然嵌入细胞膜中的蛋白质时碰了钉子。

膜蛋白是相当难以处理的,当它们从原本环境的细胞膜中移除时,经常会堆积成一团无用的物质。韩德森研究的第一个膜蛋白相当难以製备足够的量,第二个膜蛋白则是无法结晶。经过多年的挫败,他决定转向唯一可行的替代方案:电子显微镜。

当然电子显微术是否真是一个替代方案这点,在当时仍是可议的。穿透电子显微术,正如其名,运作类似普通的显微镜,不过却是用电子束而非光来穿透样品。因为电子的波长比可见光小得多,电子显微镜能够看到非常小的结构 – 甚至是个别原子的位置。

因此,理论上电子显微镜的解析度应该远高于韩德森用来研究膜蛋白的原子结构所需的解析度,但实际上这个计画几乎不可行。1930年代电子显微镜发明时,科学家认为这种技术只适用于非活体,因为高解析度影像所需的高强度电子束,会烧毁生物材料。但若减弱电子束的强度,影像则会失去对比度而变得模糊。

除此之外,电子显微术需要真空环境,这条件之下生物分子会因周遭水分蒸发而变质。生物分子乾燥之后会折叠并失去原本的结构,使得到的影像失去意义。

几乎种种迹象都表明韩德森会失败,但这个研究计画被他选择的特殊蛋白质“菌紫质”拯救了。

韩德森而言迄今最好的还不够好

菌紫质是一种光合生物体中嵌入细胞膜的紫色蛋白质,用以攫取来自太阳光的能量。并非像先前一样把敏感的蛋白质从细胞膜分离,韩德森和他的同事直接把整个紫色的细胞膜放到电子显微镜底下,这样被细胞膜包围的蛋白质会保持原本的结构。他们在样品表面加上葡萄糖溶液,用来保护蛋白质不在真空底下乾掉。

强烈的电子束是一个主要的问题,而其研究人员利用菌紫质分子堆叠在细胞膜中的特性解决了。他们并未使用全剂量的电子轰击,改以较弱的电子束流过样品。虽然这样拿到的图像并没有很好的对比度,也没办法看清个别分子,但这种蛋白质整齐堆叠成相同方向的特性,让研究人员知道所有蛋白质绕射电子的模式应该几乎相同,由此他们能够从绕射图中计算出更详细的影像 – 类似X射线晶体学中使用的数学方法。

下一个阶段中,研究人员转动电子显微镜底下的细胞膜,得到许多不同角度的影像。利用这个方法,在1975年建构了菌紫质结构的粗略3D模型(图2),显示蛋白质链是如何在细胞膜内穿越七次。

这是当年有史以来用电子显微镜得到的蛋白质影像中品质最好的,那7埃(0.0000007毫米)的解析度在很多人心目中留下了深刻的印象。不过这对韩德森而言还是不够,他的目标是能够达到X射线晶体学所能提供的解析度,也就是大约3埃,而他坚信电子显微术还可做得更好。

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图二 于1975年发表的第一个菌紫质(bacteriorhodopsin)的粗略模型(图来自于Nature 257: 28−32)

韩德森得到第一个原子解析度的影像

在接下来的几年,电子显微术的技术逐渐进步。镜片变得更好,加上冷冻技术的进展(我们后续会谈到),在测量过程中用液态氮冷却样品,防止它们被电子束损坏。

韩德森逐渐在菌紫质的模型中添加更多细节。为了获得最清晰的影像,他寻找着世界上最好的电子显微镜。每个电子显微镜都有个自的缺点,不过彼此之间有办法相互补足。终于,在1990年,也就是发表第一个模型的15年后,韩德森达到了他的目标,并发表了一个解析度到达原子尺度的菌紫质结构(图3)。

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图三 于1990年韩德森发表了一个解析度到达原子解析度的菌紫质结构

他因此证明了cryo-EM可以提供与使用X射线晶体学相同细节的影像,这是个关键的里程碑。然而,这个进展是建立在一个特殊的情况:蛋白质能够自然地在膜中整齐堆叠。很少有其它蛋白质以这种方式自发地排列。问题是这种方法可否推广:能否使用电子显微镜从随机分散在样品中并以不同方向排列的蛋白质产生高解析度3D影像?韩德森相信有办法做到,然而其他人却觉得这只是个乌托邦的理想而已。

在大西洋的另一侧,美国纽约州卫生署的法兰克长期以来也一直在寻找解决这个问题的方案。1975年,他提出了一个理论上的策略,显微镜二维图像中显然只能得到的少数资讯,可以合併得到三维高解析度的影像。他花了超过十年的时间实现了这个想法。

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图四 法兰克的三围结构影像分析

法兰克去芜存菁的影像分析法

法兰克的策略(图4)是将电子显微镜所得方位紊乱之蛋白质的微弱影像,利用电脑将之与背景区别开来。他开发了一种数学方法,使电脑能够辨识出影像中不同的重複图形。接着,电脑将相似的图形分类到同一组,并将这些图形中的讯息合併,产生出平均的、更清晰的影像。藉由这个方法,他得到了一些同种蛋白质但从不同角度照出来的高解析度二维影像。该软体的演算法于1981年完成。

下一步,是在数学上确定不同的二维影像如何彼此相关,并且基于这些讯息建立出三维影像。法兰克在1980年代中期出版了这个部分的影像分析方法,并用它产生出核醣体表面的模型,那是细胞内製造蛋白质的巨大分子机械。

法兰克的影像处理方法是cryo-EM的重要发展。现在让我们跳回到几年前 – 在1978年,当法兰克将电脑程式优化得更完美的同时,杜波克特被招募到了海德堡的欧洲分子生物学实验室,以解决另一个电子显微镜的基本问题:生物样品暴露于真空时,是如何乾燥与损坏的。

杜波克特将水变成玻璃

1975年,韩德森使用葡萄糖溶液来保护细胞膜以避免脱水,但是这种方法对水溶性生物分子无效。其他研究人员试图冷冻样品,因为冰比水蒸发得慢,不过冰晶会使电子束受到严重干扰,使得影像无法分析。

水的汽化是一个主要的难题,然而,杜波克特想到了一个可能的方法:快速将水冷却,使水分子以液体的形态固化,形成玻璃而不是晶体。玻璃看起来是固体材料,但实际上却是一种流体,因为它的分子呈现无序的排列。杜波克特意识到,如果他能够将水形成玻璃 – 也称为玻化水(vitrified water) – 电子束将平均地绕射,并产生均匀的背景影像。

一开始,研究团队试图在液氮中 -196 °C 下将微小水滴玻璃化,但只有当他们改用被液态氮冷却的乙烷时,实验才会成功。在显微镜下,他们看见了一个过去不曾见过的滴状物,他们起初认为是乙烷,但是当温度稍微升高时,分子突然重新排列,形成了一个熟悉的冰晶结构。这可说是一大胜利 – 特别是有些研究人员曾断言不可能使水滴玻璃化。我们现在相信,玻化水是宇宙中最常见的水之结构。

一种求取对比的简单技术

1982年的突破之后,杜波克特的研究小组迅速开发出了目前仍用于低温电子显微镜的技术基础(图5)。他们将生物样品 – 最初是不同形式的病毒 – 溶解在水中,然后将溶液以薄膜的形式铺展在细金属网目上。他们使用一种似弓的装置将金属网目射入液态乙烷中,使薄膜中的水玻璃化。

1984年,杜波克特发表了许多不同病毒的第一张影像,圆形和六边形的高对比病毒影像衬托在玻化水的背景中。用于电子显微镜的生物材料样品现在可以更容易地製备了,研究人员们赶快敲着杜波克特的大门来学习新技术。

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图五 杜波克特的玻化法

从团块学到革命性的进展

至此,cryo-EM最重要的一块拼图已经到位,但影像解析度仍然很差。1991年,当法兰克杜波克特的玻璃化方法製备核醣体并用自己的软体分析图像时,他获得了一个空间解析度为 40埃的三维结构。这对电子显微术来说,是一个惊人的进步,但影像只能显示核醣体的轮廓。坦白说,它看起来像一群团块,影像远远比不上X射线晶体学的原子级解析度。

由于cryo-EM除了看到不平坦的表面之外,很少能将结构细节显像出来,所以该方法有时被戏称为「团块学(blobology)」。然而,电子显微镜的每个螺帽和螺丝逐渐被优化,这最主要是由于韩德森固执地保持其远见:电子显微镜将有一天能例行地提供显示到单个原子层次的影像。解析度一个埃一个埃往前拓展,最终在2013年使用了一种新型的电子探测器,克服了最后的技术障碍(图6)。这些进步有赖下列的一些发展:讯号侦测器的进步,导致讯号/杂讯比例以及空间解析度的大幅提升;电子枪的改进;新式相位板有助于相位处理;数据收集的自动化;影像处理技术的改进以及电脑程式的开发。

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图六 电子显微镜的解析度在近几年大幅提升,从大多为模糊无形状的一团影像,进化成能以原子级的解析度观察蛋白质(影像来自于Martin Högbom,斯德哥尔摩大学)

细胞中任何隐藏的角落皆可探索

现在梦想已经实现,我们正面对着生物化学中爆炸性的发展。使得cryo-EM之所以如此的具有革命性是因为它的许多优点:杜波克特的玻化方法容易使用并且只需微量的样品,由于其快速冷却的方式,生物分子能在行动中被冻结,使得研究者能捕捉到反应过程中一系列的影像,如此他们能取得暴露出蛋白质如何行动并与其它分子作用的“影片”。

运用cryo-EM也使得我们远较以往更容易描绘膜蛋白,它们常扮演药物的标靶角色以及形成巨大的分子错合物。不过小分子无法用电子显微术来研究,但它们可运用核磁共振谱法或X-射线晶体学来显像。

在法兰克于1975年提出其广泛影像处理方法的对策之后,一位研究者写道:「如果这个方法能完美化,那幺就如同一位科学家所说的,只有天空才会是我们的极限(任何事情都是可能的)」。

现在我们已经到了那儿 – 天空的极限。透过杜波克特法兰克、与韩德森等人的研究,带来了“人类最大的利益”。每一个细胞的角落均可捕捉到原子层次的细节,而生物化学已经準备好迎接一个精彩的未来。


本文译自诺贝尔化学奖委员会公布给大众的新闻稿,原文可自以下官方网站取得:

https://www.nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/2017/popular-chemistryprize2017.pdf

若有兴趣阅读进阶的资料,请由下列网址取得:

https://www.nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/2017/advanced-chemistryprize2017.pdf

*译者简介:

林宇轩于台大化学系硕士班毕业,受教于李弘文教授,于瑞典Umeå大学做过一年交换学生。

曹一允在美国德州农工大学攻读博士,在Karen Wooley教授实验室进行研究,除翻译本文外亦负责将其中图片中文化。

蔡蕴明现为台大化学系名誉教授。

*感谢台大化学系的蔡明轩帮忙将此文放上化学系的网页。

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